Výsledky studie na 3 pacientech s monogenní poruchou křehké kůže, recesivní dystrofickou epidermolysis bullosa (RDEB), ukazují, že odstranění exonu 31, obsahujícího patogenní mutaci, obnovilo adhezní vlastnosti fibroblastů RDEB a vedlo k přesné depozici kolagenu typu VII (C7) do bazální membrány na 3D modelu kůže. Výzkum byl publikován v časopise Bioengineering & Translational Medicine.

Podle autorů vyloučení exonu 31 z keratinocytů a fibroblastů RDEB představuje první průkaz přeskočení exonu v dermálních fibroblastech. Dalšími cílenými exony COL7A1 byly 68 a 109.

„Gen COL7A1, který produkuje protein kolagen 7, je často mutován u jedinců se vzácným, ale vysilujícím stavem kůže, epidermolysis bullosa. Toto onemocnění by mohlo být léčeno pomocí genové editace, kdy se postiženému jedinci odeberou kožní buňky, jediný poškozený gen se opraví pomocí genové editace založené na CRISPR a pomocí genově upravených buněk specifických pro pacienta se vytvoří kožní ekvivalenty,“ uvedla vedoucí autorka studie Hilary Sheppardová, PhD, z University of Aukland, pro The American Journal of Managed Care (AJMC). „Tyto upravené kožní listy pak mohou být použity jako kožní štěpy s dlouhou životností k pokrytí problematických ran.“

Všichni 3 dárci měli složené heterozygotní mutace v genu COL7A1. Výzkumníci navrhli duální single-guide RNA cílenou na introny na obou stranách každé mutace. Při opravě nehomologním spojováním konců došlo ke spojení zlomových bodů a vznikly delece, které pokrývaly každý exon. V keratinocytech byl celkový podíl alel s delecí zahrnující cílový exon (ale ne další exony) 89,67 % u pacienta 1, 94,98 % u pacienta 2, 89,03 % u keratinocytů pacienta 3 a 90,76 % u fibroblastů pacienta 3. Výsledky ukázaly, že 107 ze 118 exonů lze odstranit, aniž by došlo k narušení otevřeného čtecího rámce COL7A1. Toto zjištění naznačuje, že přeskočení exonu má širokou použitelnost pro mutace specifické pro pacienta.

„Jednoduchost přenosu na bázi RNP [ribonukleoproteinu] a absence požadavku na mechanismy pozitivní selekce představuje zjednodušený pracovní postup editace, který by mohl umožnit rychlejší cestu do klinické praxe,“ napsali autoři.

Zjistili také, že duální přeskočení exonu Cas9-RNP nevedlo k detekovatelné inzerci a deleci mimo cíl, ale vytvářelo velké cílové strukturní varianty; delece exonu 31 v kožních buňkách pacienta 3 vedla k předpokládanému sestřihu mRNA a zvýšené transkripci C7; delece exonu 31 obnovila expresi proteinu C7 v keratinocytech pacienta 3. Editační protokol a systém buněčných kultur ve studii neměl negativní vliv na růst buněk. Analýza proliferace ukázala, že keratinocyty pacienta 3 měly po editaci Cas9-RNP podobnou rychlost růstu ve srovnání s neošetřenými keratinocyty a keratinocyty divokého typu po dobu jednoho měsíce.

Budoucí výzkum by měl provádět experimenty in vivo, aby se vyhodnotila dlouhodobá účinnost technik úpravy genů.

U pacientů s RDEB existuje významné riziko vzniku spinocelulárního karcinomu a jejich očekávaná délka života je obvykle 30 let. Toto onemocnění je způsobeno bialelickými mutacemi se ztrátou funkce v genu COL7A1, který kóduje řetězec C7 alfa-1; poruchy C7 mohou způsobit závažné puchýře, které mohou vést k systémovým a život ohrožujícím komplikacím.

„Náš výzkum doplňuje rostoucí počet důkazů, které prokazují, že se tento gen hodí pro vysoce účinný přístup, kdy lze jednoduše odstranit vadné oblasti, čímž vznikne mírně zkrácený, ale stále funkční protein,“ uvedla Sheppardová pro AJMC. „Tento přístup má terapeutický potenciál. Naše studie však také poukazuje na důležitost komplexního hodnocení on-target editačních událostí, protože naše analýza odhalila přítomnost odstraněných oblastí DNA, které by standardními metodami nebyly zachyceny.“

ZDROJ: Jacobson-Sive, K. Breakthrough CRISPR/Cas9 Technique Achieves 95%
Exon Deletion for Epidermolysis Bullosa Treatment. Dermatology times. 2024;
Published 2024 August 6.  

Dostupné z:
https://shorturl.at/JhNbs [cit. 2024-08-09].